调节性T细胞在脑缺血中的作用

本文原载于《中华神经科杂志》年第1期

脑缺血后产生一系列复杂的病理学变化，例如脑组织能量代谢异常、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增多、细胞内Ca2＋超载、氧自由基损伤、炎症等，这些过程交叠发生并相互促进，最终导致神经元凋亡和坏死[1]。在此过程中，免疫炎症反应贯穿始终[2]。作为免疫反应的主体，淋巴细胞被认为是影响卒中后神经炎症后果的关键白细胞亚群，其中促炎性淋巴细胞如TH1、TH17和γδT细胞会导致卒中恶化，而调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)则通过抑制炎症、阻止病灶发展和促进组织修复对缺血后脑组织发挥保护作用[3]。虽然已对Treg在缺血性脑损伤中的作用进行了大量研究，但由于研究方法的差异及其作用机制的复杂，导致对相关环节的理解并不深入。现就Treg在脑缺血中的作用和机制以及Treg作为缺血性卒中干预靶点的可能性做一综述。

1　Treg的来源和分类

Treg属于CD4＋T细胞亚群，能负向调节机体免疫功能，通过抑制多种炎症细胞的激活和促炎性细胞因子的释放来维持自身免疫稳态和免疫耐受[4]。依据来源的不同，Treg可分为天然型Treg和诱导型Treg。前者是在胸腺中发育并分化的成熟T细胞，可抑制异常增强的自身免疫应答；后者是在免疫应答过程中由初始T细胞在特定微环境和某些细胞因子诱导下分化而成，在肠相关淋巴组织、脾、淋巴结和感染组织局部产生，在黏膜免疫、抗炎、抗肿瘤和抑制排斥反应中起重要作用[5]。目前，CD4＋/CD25＋/Foxp3＋被认为是Treg的经典标记组合，而近年来也陆续发现了具有负向调节作用的CD8＋Treg亚群，其主要作用是抑制活化的T细胞[6]。

2　脑缺血后Treg数量和功能的变化

2.1　基础研究

2.1.1　脑缺血后脑内Treg数量和功能的变化

脑缺血后，神经胶质细胞首先被激活，释放肿瘤坏死因子-α等促炎性细胞因子，形成持续放大的炎症级联反应[7]。这种反应会破坏内皮细胞紧密连接，促使血脑屏障开放，还诱导血管内皮表达趋化因子和黏附分子，募集外周血中性粒细胞和淋巴细胞通过受损的血脑屏障浸润至脑实质，参与脑内免疫炎症反应[8]。

早在20多年前，研究者就已发现局灶性脑缺血小鼠脑组织内存在淋巴细胞浸润[9]。大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)小鼠模型研究显示，脑缺血早期脑内仅可检测到微量Foxp3＋Treg表达[10]。在脑缺血再灌注第1天，脑组织内Treg约占全部CD4＋T细胞的10%，而对照组不足5%，此时Treg主要位于血管内[11]。第5天时，Treg出现在梗死侧半球靠近血管的脑实质处[12,13]；7、14和30d时脑实质内出现大量Treg浸润，分别占全部CD4＋T细胞的21%、33%和35%，不仅高于对照组，也显著高于外周淋巴器官内的Treg比例[5]。短暂性局部脑缺血后第1周，脑内仅有少量CD25＋/Foxp3＋Treg浸润，占全部CD4＋T细胞的比例不足5%[14]；相比之下，永久性MCAO模型的缺血半球则存在大量T细胞和Treg，其中Foxp3＋Treg约占CD4＋T细胞总量的20%[13]。这说明永久性闭塞模型导致的神经炎症反应更为严重[15]。

2.1.2　脑缺血后外周Treg数量和功能的变化

外周免疫系统与脑组织之间存在密切联系。急性脑缺血诱导的外周免疫反应包括急性期的外周免疫激活[16]以及后期的免疫抑制综合征[17]。虽然脑缺血早期脑组织内仅有少量Treg浸润，但外周免疫系统中的Treg在脑缺血后最初3d即可发挥免疫调节功能并影响脑缺血转归[18]。小鼠MCAO后外周血T细胞总数显著减少，而Treg所占比例却显著增高[16]。此外，小鼠外周血Treg数量在脑缺血后第1天减少，第3天恢复正常，之后又增多[10,11]。由此推测，脑缺血早期Treg从外周向中枢迁移[11]，而后期由于脑梗死导致交感神经兴奋刺激胸腺和脾脏释出Treg[19]。预先脑室注射抗CD25特异性抗体清除Treg或诱导型Foxp3基因敲除小鼠，其MCAO后3d时脑梗死体积与对照组无显著性差异[10,20]，说明Treg可通过作用于外周免疫系统中的靶细胞对脑缺血产生早期影响。脑缺血小鼠静脉输注纯化Treg后，Treg能迅速在血液中发挥抗炎作用从而改善卒中转归，提示Treg可通过抑制外周免疫炎症细胞发挥神经保护作用[12,21]。

2.2　临床研究

目前有关急性缺血性卒中患者外周血Treg的临床研究不多，认为Treg在缺血性卒中后发挥免疫抑制功能[22]，而且女性患者Treg抑制免疫反应的能力较男性降低，可能与性激素有关[23]。有研究显示缺血性卒中后外周血Treg数量迅速增多[23]，但也有研究得出了相反的结果[24]。还有研究显示，缺血性卒中患者在发病后第1天外周血Treg数量减少，第7天和第21天数量多于正常水平，且3个时间点Treg占全部CD4＋T细胞的比例均显著增高[23,25,26]。总之，临床研究支持Treg通过外周免疫调节影响缺血性卒中转归这一结论，但根据卒中本身的严重程度和患者各自的病理学特点，Treg对缺血性卒中转归的影响有一定的差异。

3　Treg在脑缺血中的作用

既然Treg参与了缺血性卒中后神经炎症反应的调节，因此研究者试图通过抑制Treg功能以进一步揭示其在脑缺血中的作用。其中，一部分研究证实抑制Treg功能会导致脑梗死体积增大[13,20,27]，而另一部分研究则显示抑制Treg功能对脑梗死体积没有影响[10,12,13,20,28]，还有1项研究观察到脑梗死体积缩小[11]。对上述研究进一步分析发现，其中3项研究使用了Foxp3基因敲除小鼠，但敲除方法并不相同[11,20,28]；而其他研究则通过注射白喉毒素受体构建不同Foxp3缺失模型，且采用的白喉毒素处理方案各不相同。以上研究对Treg的抑制效率在65%～90%之间，并且多数超过80%。然而，由于采用的动物模型、Treg功能抑制方法及抑制效率各不相同，因此很难判断Treg在脑缺血中的确切作用。进一步从缺血性损伤程度方面进行分析发现，抑制Treg功能会导致永久性脑缺血模型以及中度脑缺血模型的梗死体积增大[13,27]，而在短暂性脑缺血模型的梗死体积无影响[10,12,13,20,28]甚至有所缩小[11]。

尽管上述研究结果仍有矛盾之处，但越来越多的研究者尝试通过增加Treg数量来探讨其对脑缺血的影响。例如，通过输注体外培养的Treg或利用CD28激动剂诱导Treg体内增殖等方法增加实验动物体内Treg数量。在此类研究中，多数研究显示梗死体积缩小和神经功能改善[12,18,20,21,27,29,30,31,32,33]，但也有研究显示梗死体积增大和神经功能损伤加重[11,34]。即使使用的模型和增加Treg数量的方法相同，也可能得出相反的结论。不过，有研究认为脑缺血后神经功能恶化与Treg的免疫抑制功能无关，而可能是Treg与内皮细胞和血小板之间的相互作用促进了血栓形成[11,34]。

4　Treg作为缺血性卒中干预靶点的可能性

4.1　Treg抑制脑神经炎症反应的机制

Treg主要通过细胞接触和非接触途径发挥免疫抑制功能。Treg通过促进抗炎性细胞因子[白细胞介素(interleukin,IL)-10和转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-β]和免疫抑制因子(CTLA-4、CD39和PD-1)表达以及抑制促炎性细胞因子(IL-1和IL-2)和细胞溶解分子(颗粒酶、穿孔素)分泌来发挥免疫抑制功能[35]。

促炎性淋巴细胞以及脑内小胶质细胞/巨噬细胞是脑损伤后Treg发挥免疫抑制作用的主要靶细胞[12,13,20]。脑缺血后，Treg分泌IL-10和TGF-β抑制小胶质细胞活化和减轻脑内炎症反应[29]，还能抑制中性粒细胞表达基质金属蛋白酶-9，从而保护血脑屏障[18]。此外，Treg不仅可直接抑制效应T细胞的活化增殖以及IL-2等促炎性细胞因子的分泌，还通过表达TGF-β、IL-10等抗炎性细胞因子来抑制效应T细胞的活性。TGF-β和IL-10本身就具有抗炎和神经保护作用。脑内IL-10主要来源于Treg、Breg和小胶质细胞/单核细胞，是Treg调节卒中后神经炎症反应过程中的关键神经保护性细胞因子[36,37,38,39]。促进淋巴细胞合成IL-10[20,33,36,40]或外源性给予IL-10[38,39,41]均可缩小梗死体积和改善神经功能。TGF-β能促进T细胞向Treg分化，定向调节Treg的数量和功能[42]。Treg高度表达IL-2受体，通过竞争效应T细胞对IL-2的利用而抑制其活化并诱导其凋亡[4]。Treg能抑制树突状细胞和自然杀伤细胞的功能，进而抑制效应T细胞的活化[43]。研究显示，脑出血后Treg诱导小胶质细胞从M1向M2型转化[44]。程序性死亡蛋白-1(programmeddeath-1,PD-1)为重要的免疫抑制分子，与其配体PD-L1结合后传递抑制信号，对记忆和效应T细胞功能进行负性调控，维持机体免疫稳态[45]。PD-1/PD-L1通路不仅直接诱导CD4＋T细胞分化为Treg，还通过增强Foxp3表达或与TGF-β结合来诱导Treg分化；PD-1/PD-L1能促进Treg细胞分泌IL-10，从而增强Treg的免疫抑制功能；PD-1/PD-L1缺失将导致Treg功能受损[46,47]。此外，脑缺血后PD-1/PD-L1表达显著上调，而敲除PD-1基因后脑梗死体积增大、小胶质细胞活化增多并伴有大量外周炎症细胞浸润[48]。

总之，脑缺血后期Treg能通过减少T细胞浸润[12,13]、抑制效应T细胞增殖[20]、抑制细胞因子产生[12,27,32]、减少小胶质细胞/单核细胞活化[13]或促使小胶质细胞M2型极化[27]等机制缩小梗死体积和改善神经功能。

4.2　导致神经炎症反应中Treg功能差异的可能原因

4.2.1　继发血栓形成

常用的MCAO模型是一种可发生侧支循环重建的短暂机械性血管闭塞模型，其典型特点是由于微血栓形成和相应的炎症反应导致迟发性神经元损伤[49]。目前，导致短暂机械性血管闭塞时血栓形成和炎症发生的原因尚不清楚，但普遍认为与再灌注引起的内皮细胞激活、再灌注速度(迅速还是逐渐)及血管闭塞时间长短有关[50]。脑缺血再灌注导致内皮细胞活化、血栓形成和微血管功能障碍级联反应，不仅使脑梗死进一步发展，还引起血管炎症和神经炎症反应[2]。而Treg与活化的内皮细胞和血小板之间的相互作用则促进了血栓形成。

4.2.2　缺血性损伤程度的影响

对卒中患者和动物模型进行的研究显示，只有脑组织广泛损伤后才会出现外周免疫抑制[2,17,51,52]。虽然只要有实质性脑损伤，就会发生淋巴细胞减少和单核细胞亚群改变，但轻微缺血性损伤仅会诱导小幅免疫调节而并不出现免疫抑制综合征。因此，Treg在存在过度免疫反应的脑缺血模型中具有决定性作用，而对存在轻度炎症反应的脑缺血模型仅起到次要作用。

4.2.3　体内免疫环境的影响

微血栓形成和外周免疫的改变以及神经炎症反应的严重程度均可能直接影响天然Treg的功能。对癌症[53,54]等疾病的研究显示，体内Treg的功能依赖于其所处的免疫环境。因此，在急性脑损伤和神经退行性病变模型中，Treg数量不论是减少还是增加，都可能对结果产生负面影响[55,56,57]。因此，须根据使用的卒中模型和Treg的靶向机制来确定Treg能否在卒中后发挥有益作用。

5　结语

目前有关Treg在脑缺血中作用的研究有很多。由于基础研究使用的实验模型不同、临床研究患者的病情严重程度及并发症的不同以及其他因素(例如血栓和继发微血栓形成、病变大小、再灌注损伤、Treg的非免疫功能、体内环境对Treg的影响等)，导致Treg对脑缺血后中枢神经系统和外周免疫系统的影响及机制至今尚未完全阐明。但可以肯定的是，Treg能高度有效地调节机体免疫，而且其在脑缺血中的作用机制比目前认识到的更加复杂。

今后可着重研究以下问题：(1)在同一实验中采用不同的动物模型和干预方式研究Treg对脑缺血的影响；(2)血栓和继发性微血栓形成对于诱导血管炎症反应和神经炎症反应的影响及其机制；(3)缺血损伤程度和再灌注损伤对继发性神经炎症反应的影响；(4)体内免疫环境改变对Treg功能的直接影响；(5)患者个体差异(如性别、年龄、并发症、病情严重程度等)对Treg功能及卒中转归的影响；(6)确定Treg作为免疫调节剂治疗缺血性卒中的机制。上述问题的解决有利于明确Treg在脑缺血中的作用和机制，从而有助于采取更加确切的个性化Treg靶向免疫疗法治疗缺血性卒中，以提高患者的生存率和生活质量。

参考文献略

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