抽丝剥茧,隐藏病原真凶竟是hel
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心感染科
作者：罗丽娟
审阅：曹清
导语
病原宏基因组学正在迈入2.0时代，从宏基因组学扩展到宏转录组学，从病原体单维度检测走向病原，宿主和药物作用多维度分析。今天，我们分享一例来自上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心感染科的经典案例，看看传统微生物学如何与基因组学相结合，从病原体单维度走向病原体和宿主双维度,帮助医生明确病因。
01
病史简介
患儿，男，10岁，浙江人。
主诉：发现嗜酸性粒细胞增高1年余，间断性发热2次。
现病史
患儿1年前体检时发现外周血嗜酸粒细胞增高，就诊外院后诊断嗜酸粒细胞增多症，泼尼松治疗2月后嗜酸性粒细胞较前明显降低后停药。停药后8个月病情复发，相继予强的松、地塞米松再次治疗2个月，嗜酸性粒细胞未见明显降低。自发病以来患儿曾发热两次，第一次为发病后1月余，发热1周余，经抗感染（头孢克洛）治疗后好转停药，此次入院前20余天，患儿再次出现发热，热峰38度左右，并伴有呕吐，呕吐物为胃内容物，非喷射性，精神软，食欲不振，嗜睡，无意识障碍，无抽搐，未予特殊处理，后体温降至正常，呕吐消失。10天前患儿体温复升，波动于37.5-38℃之间，呕吐次数增多，至我院门诊就诊，予头孢唑肟抗感染治疗，病情未见好转，3天前患儿热峰上升至38-39℃，仍有呕吐，性质不详，为进一步诊治收入院治疗。
患儿近日无咳嗽、流涕，无腹痛、腹泻，无皮疮，无抽搐、晕厥，无关节肿痛，二便无殊。自发病以来患儿体重下降3公斤。
既往史及个人史
患儿生长发育与同龄儿相同；否认既往各系统疾病发作史；否认麻疹、水痘、猩红热、流行性腮腺炎、肝炎、结核等病史。家住城市，否认疫区生活及游玩史，否认生食、冷食等不良饮食史；否认猫抓、宠物咬伤等病史；-06-11（11个月前）淋巴结活检，病理提示：淋巴结血管淋巴样增生伴嗜酸粒细胞增多；家中独子，父母健康。
02
入院检查
体格检查
体温：腋温38.4℃，脉搏:欠/分，呼吸:24次/分，血压:98/68mmHg，身长/高：cm，体重:29.5kg。
神志清，精神反应可，发育正常，面色正常，浅表淋巴结未及。口腔黏膜可见大片白色膜状物。心率次/分，心律齐，心音有力，未及明显杂音。双侧肺部呼吸音清，无罗音。肝脏肋下3cm，剑突下刚及，质硬。脾脏肋下未触及。颈抗可疑阳性，脑膜刺激征：布氏征阴性，克氏症阴性，生理反射：膝反射正常，踺反射正常。病理反射：巴氏征阴性。
实验室及影像学检查
血常规+CRP：CPR1mg/L,WBC10.1*10^9/L,N40.7%,L16.3%,EOS40.90%,嗜酸性粒细胞绝对计数4.12*10^9/L，HGBg/L,PLT*10^9/L
腹部B超：肝脾增大，肝实质回声不均匀，脾脏内低回声团块，肝门一头周围淋巴结肿大。
03
临床分析
病史特点：10岁男童，因“发现嗜酸性粒细胞增高1年”入院。入院查体发现其口腔黏膜大片白色膜状物，肝脏增大，颈可疑强直，外周血嗜酸性粒细胞比例及绝对值均明显增高，腹部B超提示肝脾增大，回声不均匀等。诊断及鉴别诊断考虑如下：
思考
1．肿瘤性疾病：包括原发性高嗜酸性粒细胞综合征、急性嗜酸性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、髓系肿瘤、部分淋巴瘤、部分实体肿瘤等；
2．感染性疾病：寄生虫感染最为常见，其次为真菌感染，偶有少量病毒感染可引起嗜酸性粒细胞增高；
3．过敏性疾病：过敏性疾病通常只引起嗜酸性粒细胞轻度增高；
4．结蹄组织/风湿性疾病：嗜酸性肉芽肿性血管炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、炎症性肠病、干燥综合征等；
5．免疫缺陷性疾病：高IgE综合征、IPEX、ZAP-70缺陷等。
04
进一步检查、诊治过程及治疗反应
患儿入院后结合嗜酸性粒细胞增多的各种原因行相关检查，同时因其发热、呕吐、颈项强直等，中枢感染需考虑，故行腰穿检查。后结果陆续回报：G试验pg/ml，头颅MRI：右侧额颞叶交界处、右侧基底节、大脑脚多发异常信号；胸部CT增强：纵膈淋巴结稍增大，双侧腋下多发小淋巴结，右侧下胸膜增厚；腹部CT增强：肝内多发低密度灶，脾脏密度不均匀；脑脊液常规：浑浊，WBC*10^6/L,单核55%，多个核45%，生化：GLU1.1mmol/L，CLmmol/L，PROTmg/L;脑脊液涂片及培养：白色假丝酵母菌。同时行脑脊液病原学PCR检测，提示为白色念珠菌。诊断为播散性念珠菌病。予两性霉素B脂质体+氟胞嘧啶抗真菌感染。
检验项
结果
参考值
单位
IgG
14.3
7.0-15.5
g/L
IgA
1.81
0.58-2.91
g/L
IgM
1.99
0.49-2.40
g/L
IgE
IU/ml
表1患儿病初体液免疫结果
检验项
结果
参考值
单位
NK细胞
.35
90
-
Cells/ul
CD3+.01
-
2
Cells/ul
CD3+/CD4+
.05
-
Cells/ul
CD3+/CD8+
.23
-
Cells/ul
CD3-/CD19+
.22
-
Cells/ul
表2患儿病初细胞免疫结果
同时患儿免疫功能初筛结果显示除IgE增高以外未见明显异常（见表1与表2），但其多项细胞因子明显低于正常水平（见表3），故继续行基因检测，以明确其有无免疫缺陷性疾病。
IL-2
IL-4
IL-6
IL-10
TNF
INF-γ
IL-17a
治疗前
0
0
0
0.94
0
12.4
0
正常值
(pg/ml)
0.64
-
8.84
0.1
-
3.88
1.0
-
15.8
0.45
-
4.98
0.1
-
5.97
0.44
-
16.2
16.67
-
65.76
表3患儿病初细胞因子检测结果
治疗2周、3周后复查脑脊液，未见明显好转（见表4），复查头颅MRI显示：右侧颞叶、基底节区多发异常信号，较前片稍有好转，复查腹部CT显示：肝内门脉周围见低密度影，脾脏密度不均匀，与老片相似（见图1）。
此时又加用G-CSF增强中性粒细胞功能治疗，后继续复查脑脊液及头颅及腹部影像学，病情得到良好控制（见表4及图1）。
治疗过程中患儿基因检测结果回报：CARD9基因纯合突变（见图2）。
脑脊液白细胞
脑脊液蛋白
嗜酸性粒细胞比例
嗜酸性粒细胞计数
G试验
治疗前
40.9%
4.12*10^9/L
pg/ml
单纯抗真菌治疗时
0
30.9%
2.29*10^9/L
-
加用G-CSF后
10%
10%
随访中
0
3%
3%
表4：患儿治疗前后化验结果对比
图1：治疗前后患者头颅MRI及腹部CT扫描对比：
A：治疗前；B：抗真菌药物治疗后；C：联合G-CSF治疗后；D：随访。
图2患者、患儿父母及正常对照
的CARD9一代测序验证结果
05
最后诊断与诊断依据
（1）播散性念珠菌病：患儿有原发性免疫缺陷病的基础，中枢神经系统、肝脏、脾脏等多部位累及，外周血嗜酸性粒细胞增高，脑脊液涂片及PCR均证实为白色念珠菌，经抗真菌治疗后恢复，故诊断。
（2）原发性免疫缺陷病：患儿出现机会性念珠菌感染，查细胞因子显示多种细胞因子均明显下降，通过基因检测证实为CARD9基因缺陷，故诊断。
06
经验与体会
（1）外周血嗜酸性粒细胞增多原因的鉴别：主要包括肿瘤性疾病、感染性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病及免疫缺陷性疾病等。面对这样的病人，我们需要从以上这几方面进行重点排查。该患儿病程较长，入院后结合鉴别诊断的病因进行了相关的辅助检查，在排除其他原因的同时最终通过G试验、脑脊液涂片、病原PCR、头颅MRI及腹部CT等检查确证为播散性念珠菌病。
（2）侵袭性念珠菌感染的治疗：初始予AmB治疗1-2周，继以口服氟康唑数月为首选治疗方案，如患者病情较为稳定，也可初始治疗选用氟康唑。备选治疗方案为先以棘白菌素治疗数周后，继以氟康唑治疗。疗程应持续至病灶消散，以防复发，常需数月。进行化疗或干细胞移植者需在免疫抑制期全程予以抗真菌治疗。在单纯抗真菌治疗效果差时，加用G-CSF免疫治疗后好转。
（3）大多数侵袭性真菌感染是由于免疫状态的改变而发生的。单纯抗真菌治疗的防御功能作用不大，有时并不能取得满意疗效，宿主免疫缺陷在真菌感染中发挥的关键作用引发了医学界辅助免疫疗法的兴趣，这种疗法能够增强重要的免疫效应子功能，改善治疗结果。
目前研究较多的抗真菌免疫疗法集中在细胞因子治疗方面，其原理为白细胞介素(IL)、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、及肿瘤坏死因子(TNF)等可增加中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等效应细胞的数目或增强功能，调动机体抵抗力以杀灭病原真菌。将GM-CSF、G-CSF、INF应用于真菌感染的治疗方面的报道，并取得了显著的疗效。
（4）念珠菌感染的危险因素包括：先天性或者获得性免疫功能低下（化疗后、移植后、激素应用后、中性粒细胞减少、HIV等）、粘膜屏障破坏（胃肠手术后、烧伤）、各种侵入性导管、长期广谱抗生素应用、早产、糖尿病等。
人类念珠菌感染的基因易感性目前认识到的最常见的包括STAT1、STAT3、CARD9、DOCK8、TYK2、IL-17F、IL-4、IL-10等。CARD9存在于人类免疫细胞胞质中，作为固有免疫细胞表面模式识别受体的下游关键连接蛋白，接收识别受体的转导信号，激活下游炎症信号通路，促进炎症因子的产生。其介导的信号通路被认为是连接宿主抗真菌天然免疫与适应性免疫的桥梁。由于CARD9基因突变，患者外周血促炎因子如TNF-a、IL-6、IL-1β、IL-8、L12p70.IL17、GM-CSF等分泌减少，因此导致其抗真菌机制受到抑制。针对患者体内抗真菌免疫细胞因子分泌减少，有报道对白念珠菌性脑膜炎患者进行GM-CSF或G-CSF辅助治疗，患者症状缓解，脑脊液细胞、蛋白及糖类水平逐渐恢复正常，体內L-17分泌水平趋于正常。
参考文献：
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