神外专题六悦灵胶修复颅骨缺损
金葡液以纤维蛋白胶为载体
修复大鼠颅骨缺损
山西医科大学第一临床医学院骨科余建平
医院骨科苏云星
医院医学情报图书资料室刘芳
摘要
目的：初步探讨金葡液以纤维蛋白胶为载体修复骨缺损的可行性。
方法：选用Wistar大鼠30只在颅顶骨两侧对称各制造直径为5mm的圆形骨缺损模型后分为实验组、对照组及空白组,将纤维蛋白胶-金葡液复合物植入骨缺损处作为实验组,单纯纤维蛋白胶植入作为对照组,空白组不植入任何物质。于术后4,6周行大体观察,X线拍片,组织学检查,修复骨灰重与湿重测定。
结果：术后4,6周,X线片显示实验组缺损区的成骨面积百分比明显大于对照组及空白组,三组两两比较差异均有统计学意义(P0.01);术后6周,组织学检查,实验组骨缺损内可见纤维蛋白胶已完全吸收,缺损已骨性愈合,对照组缺损内纤维蛋白胶已降解吸收,缺损边缘有大量新生骨质,空白组缺损边缘亦可见到少量新生骨质,其他部分为致密纤维结缔组织覆盖;修复骨湿重/灰重比值低于对照组与空白组,三组比值两两比较差异均有统计学意义(P0.01)。
结论：金葡液以纤维蛋白胶为载体修复骨缺损是可行的,能减少金葡液局部注射的缺陷,提高其药物疗效。
骨缺损修复一直是困扰骨科临床的难题,外伤、感染、肿瘤造成的骨缺损,都将引起严重的功能障碍和畸形。对此,唯一可行的治疗方法是修复骨缺损,以恢复功能和矫正畸形[1,2]。金葡液是从金黄色葡萄球菌的代谢产物中提取的一种新型生物制剂。常被用来治疗骨不愈合、延迟愈合或骨缺损等,已有众多动物实验及临床观察证实它能够促进骨折端骨痂生长,目前大部分研究集中于金葡液的局部注射[3,4],然而局部注射存在许多缺陷,能否借助一种载体,复合应用克服这些缺陷呢?本研究用纤维蛋白胶作为金葡液的载体,与金葡液组合后用于修复大鼠颅顶骨骨缺损,现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康Wistar大鼠,雌雄不限,体重g,由山西省中医研究所实验动物中心提供。
1.2 纤维蛋白胶的配制及纤维蛋白胶-金葡液复合物的制备
纤维蛋白胶包括四种成分:浓缩的纤维蛋白原(全蛋白mg/ml),纤维蛋白溶解酶抑制剂(0KIU/ml,KIU为胰激肽蛋白原酶抑制单位KallidinogenaseInactivatorUnits),干凝血酶(IU/ml)和氯化钙(40mmol/ml)。纤维蛋白原按体积比1∶1溶解于纤维蛋白溶解酶抑制剂,凝血酶按体积比1∶1溶解于氯化钙溶液,将这两种溶液各2ml分别抽吸到相应的注射器,放入特制的推液器上,使应用这两种成分时能等量即时混合,然后把针座固定在推液器上以备用。纤维蛋白胶-金葡液复合物的制备:用2个1ml注射器各抽取0.3ml金葡液分别加入配制好的纤维蛋白原溶解液和凝血酶溶解液中,抽吸注射器使腔内形成负压,使两种溶液充分混合后备用。
1.3 实验方法
将实验动物随机分为三组:A组、B组和C组,按体重每g给予10%的水合氯醛0.4ml腹腔注射麻醉,剪除颅顶部毛发,消毒,沿头颅正中作切开,在骨膜下向两侧翻瓣,用牙科钻配5mm的钻头在生理盐水冲洗冷却下,于每只大鼠双侧顶骨上各钻一个直径5mm的圆形贯通骨缺损,术中勿伤及硬脑膜。两个骨缺损间相距3mm。A组10只左侧植入纤维蛋白胶-金葡液复合物,右侧单纯植入纤维蛋白胶。B组10只左侧植入纤维蛋白胶-金葡液复合物,右侧不植入任何物质。C组10只左侧不植入任何物质,右侧植入纤维蛋白胶。创口分层缝合。统计分析中把植入纤维蛋白胶-金葡液复合物的A组左侧与B组左侧作为实验组,单纯植入纤维蛋白胶的A组右侧与C组右侧作为对照组,其余为空白组。
1.4 测定项目
1.4.1 大体观察
术后观察动物饮食、日常活动能力及伤口愈合情况。
1.4.2 X线拍片
术后4周、6周,行颅顶骨X线正位片。采用Photoshop7.0软件对实验组、对照组及空白组三组动物颅顶骨标本缺损区进行阻射面积占总缺损面积百分比的比较,观察各组的成骨差异。
1.4.3 组织学检查
术后6周处死动物,取颅盖骨标本,脱钙、脱水、横向石蜡包埋,作厚3μm的序列切片,HE染色,普通光镜下观察植入材料的降解及比较缺损区的新骨形成情况。
1.4.4 修复骨灰重与湿重的测定
修复骨湿重/灰重比值反映了骨组织生成及钙盐沉积的多少,比值越大,说明灰重占的比例越小,证实骨组织及钙化程度越低。术后6周,沿原骨缺损外1.5mm取出标本,去除附着的软组织,电子天平称其重量(湿重),℃高温24h后,称取其重量(灰重),计算每个标本湿重/灰重比值,分析新骨形成量与钙化程度[5]。
1.5 统计学分析
所有实验数据均以x±s表示,所有实验数据均用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,采用单因素方差分析,若差异有统计学意义再用SNK法行多重比较,P0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
术后所有动物活动自如,饮食正常,伤口均无感染、破溃和分泌物,全部伤口均Ⅰ期愈合。
2.2 X线拍片
术后各周,实验组缺损区的平均成骨面积百分比(即缺损区X线阻射面积占总缺损面积的百分比)明显大于单纯植入对照组及空白组,且对照组的平均成骨面积百分比又大于空白组,三组两两比较差异均有统计学意义(P0.01),见表1。
2.3 组织学检查
实验组骨缺损内可见纤维蛋白胶已完全吸收,骨缺损已骨性愈合,新骨基本上接近于正常颅骨骨组织。对照组缺损内纤维蛋白胶已降解吸收,缺损边缘有大量新生骨质,在缺损中央部位结缔组织内可见一些独立的骨岛,新骨呈细的骨小梁及编织骨状态。空白组缺损边缘亦可见到新生骨小岛,部分可见编织样骨,但仅限于缺损边缘,其他部分为致密纤维结缔组织覆盖,新骨形成面积明显少于实验组和对照组,见图1。
2.4 修复骨湿重/灰重比值
结果显示:实验组修复骨湿重/灰重比值(2.±0.)明显低于对照组(5.±0.)及空白组(8.±0.),揭示实验组中修复骨生成量及钙化程度高于对照组与空白组,且对照组中修复骨生成量及钙化程度高于空白组,三组两两比较差异均有统计学意义(P0.01)。
3 讨论
骨缺损范围的大小直接关系到实验的客观性和可靠性。Bosch等[3]为评价大鼠顶骨直径5mm的缺损作实验是否可靠,在5-6月龄Wistar大鼠双侧顶骨避开矢状窦,各造成一个5mm的骨缺损,术后6个月及12个月,除了缺损边缘有极少量骨形成外,没有一个缺损有自发性骨再生的迹象。本实验在g左右Wistar大鼠颅骨造成5mm的圆形骨缺损,术后6周空白对照缺损内大部分为纤维组织占据,可以阻止缺损内成骨细胞的生长,很难自行达到骨愈合。此外,在实验分组中对动物左右两侧进行不同处理,且同一处理都在动物的同一侧进行,其目的主要是尽量减少实验过程中因个体差异和同一动物不同部位所造成的误差。
金葡液又名骨折愈合刺激素,是利用现代生物技术从金黄色葡萄球菌的代谢产物中提取的含有多种生物活性成分的新型生物制剂[7],具有生长调控因子、鸟氨酸及内、外源性酶的作用[8]。它能通过多种生物活性分子的协同作用,使骨折区毛细血管增生,促进骨细胞本身及周围组织血运增加,从而提供丰富的营养物质,启动骨细胞代谢,加速新骨形成,使坏死区消失,骨小梁重建,达骨折愈合[9]。
目前,临床上大部分集中于金葡液局部注射的疗效观察。而局部注射的缺陷为:
①多次注射容易增加感染机会;
②感染伤口在骨折端附近不能用;
③随着骨痂生长,注药变得困难,必须根据X线片调整进针部位,角度;
④注药必须选择在术后一周,以免因伤口引流或渗液致药物溢出,效价低。
从理论上讲,如果用某一载体携带金葡液放入骨缺损处,不仅能够为骨再生创造条件,而且可以避免以上缺陷。纤维蛋白胶(fibrinsealant,FS)是由数种血浆蛋白成分组成的一种可降解的复合制剂,研究发现FS不仅具有封闭创面、止血、促进愈合、生物黏合等多种功能,而且生物相容性良好、易于被人体吸收,并可促进组织再生,已广泛用于外科许多领域[10-12]。研究表明[13,14],纤维蛋白胶可以作为抗生素止痛药及抗肿瘤药物的缓释载体,应用于许多临床科室。本实验就是采用纤维蛋白胶作为金葡液的载体修复骨缺损,且从实验结果可知:空白组表现出爬行替代成骨,但仅在缺损边缘有骨痂形成,对照组在相同的时间内较空白对照组的缺损修复程度大,但仍没有完全修复缺损,这可能是双重爬行替代的结果:一种是自身爬行替代,另一种是FS的骨传导作用。FS只具有骨传导作用而没有骨诱导能力已经被大量的实验所证实[15,16]。骨传导作用是利用植入材料使宿主骨以爬行替代的方式修复骨缺损,实验组则表现出完全修复骨缺损能力,这可能是自身爬行替代,金葡液促进成骨及FS载体等三重作用的结果,在修复方面明显优于前两组,统计学分析也证明与前两组具有统计学差异。因此,用纤维蛋白胶作为金葡液的载体修复骨缺损是可行的,可以避免金葡液局部注射的缺陷,能够减少金葡液的外溢,使局部保持了药物浓度,增加了药物疗效。但是,金葡液以纤维蛋白胶为载体时的用量还需进一步的探讨。此外,还应在进一步的研究中解决长期保持局部有效浓度的方法。
