冠状病毒:可能引起脑炎的病原体
医院神经内科刘韬冯国栋译
1.背景简介
脑炎(Encephalitis)通常指包括病毒感染在内各种可能原因引起的脑炎。总的来说,病毒感染是人类最常见的脑炎病因。美国疾病控制和预防中心(CDC)估计,美国每年的虫媒病毒性脑炎新发病例通常在至例之间。尽管每年报告的各种病毒引起的脑炎病例有几千例,疾病控制和预防中心怀疑还有更多的病例没有报告。事实上,脑炎可以伴发于如感染性呼吸道疾病等常见的病毒感染,而有时后者的症状和体征可能掩盖并发的脑炎。临床相关的病毒性脑炎最常影响儿童、年轻人或老年人。同时,特定病毒的性质、宿主的免疫状态以及各种遗传和环境因素等其他因素的作用在病毒性脑炎的发生发展过程中也很重要。
病毒性脑炎的病理生理学根据所涉及的病毒家族不同而有所不同。脑炎有两种形式:原发性脑炎,即中枢神经系统的直接病毒感染;继发性脑炎,即病毒感染首先发生在身体的其他部位,然后传播到大脑。病毒可通过两种不同的途径进入中枢神经系统:血行播散或神经元逆行播散。血行播散是最常见的途径,它涉及到血液中特定病毒的存在(病毒血症),病毒既可以在一段时间内保持游离状态,也可以感染白细胞并使后者将成为某种病毒的储存库。其中后一种情况又称为“特洛伊木马”,是人类免疫缺陷病毒(HIV)传播到人类中枢神经系统的途径。虫媒病毒也可通过血行途径进入中枢神经系统,在中枢神经系统诱发人畜共患性脑炎,而病毒通过节肢动物和各种脊椎动物(尤其是鸟类和啮齿动物)叮咬的从而完成感染循环并得以存活。被昆虫叮咬后,病毒可在易感动物皮肤局部复制后通过血液传播。
另一种病毒向中枢神经系统传播的方式是逆行性神经元传播,即特定的病毒感染周围神经元,利用细胞内的转运机制进入中枢神经系统。
神经侵袭性病毒可通过诱导宿主产生不适当的免疫反应(病毒诱导的神经免疫病理)和/或通过病毒复制直接导致中枢神经细胞损伤(病毒诱导的神经病理)。在疱疹病毒(HSV)、狂犬病或一些虫媒病毒感染后引起急性脑炎中,病毒复制发生在脑组织本身,可能导致灰质的损伤。狂犬病病毒通常通过周围神经逆行性传播到中枢神经系统,而HSV传播到中枢神经系统的可能途径之一是通过嗅神经传播。
病毒引起的脑炎一般可分为四类。(1)虫媒病毒:主要是由东马脑炎、日本脑炎、拉克罗斯脑炎、圣路易斯脑炎、西马脑炎、西尼罗病毒脑炎等病毒引起的急性脑炎。这些病毒通过受感染的蚊子和/或蜱虫叮咬传播给人类。(2)肠道病毒:如柯萨奇病毒或脊髓灰质炎病毒。这些病毒通过粪口途径传播。感染可导致多种症状,从轻度呼吸道疾病(普通感冒)到口蹄疫、急性出血性结膜炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、严重的新生儿败血症样疾病和急性弛缓性麻痹。(3)疱疹病毒:是引起脑炎的另一个主要原因。该病毒家族成员包括HSV、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)。它们具有高度传染性,因为当感染者产生病毒时,它们即可发生传播。(4)其他病毒:极少数情况下,在麻疹、腮腺炎和风疹等儿童病毒性疾病后可继发脑炎。最近,呼吸道病毒被发现与脑炎密切相关,如流感病毒和冠状病毒等。
2.冠状病毒
冠状病毒是普遍存在的呼吸道和肠道病原体。它们还代表了一类在包括人类、猪和啮齿动物在内等各种宿主中具有亲神经性和神经侵袭性的病毒。冠状病毒是一组有包膜的、单链多聚腺苷酸化的正链RNA病毒,在所有RNA病毒中拥有最大的基因组(约30kb)。它们在受感染细胞的细胞质中使用一种病毒RNA依赖性RNA聚合酶进行复制,而这种酶在病毒进入宿主细胞后很早就从病毒基因组RNA被翻译。冠状病毒首先以呼吸道和粘膜表面为目标,然后,根据宿主和病毒株的不同,可能扩散到其他组织(大脑、眼睛、肝脏、肾脏和脾脏),并导致一系列疾病,如肺炎、脑炎、神经退行性脱髓鞘、肝炎、肠炎和肾炎等。
人类冠状病毒(HCoV)有五种不同的毒株;HCoV-E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1与SARS病原体SARS-CoV。在这5个毒株中,至少HCoV-E、HCoV-OC43以及SARS-CoV具有神经侵袭性,并可在人脑中检测到相应的病毒RNA。
然而,目前对这些人类冠状病毒入侵和感染中枢神经系统的能力了解尚不完善。另一方面,与HCoV-OC43对应的小鼠冠状病毒,即小鼠肝炎病毒(MHV),代表了该家族最典型的模型之一。MHV可感染小鼠和大鼠,其中一些毒株具有神经嗜性和神经侵袭性,并可引起从肝炎到脑炎和慢性脱髓鞘改变等一系列疾病。
2.1小鼠肝炎病毒:一种引起脑炎的病原体
MHV表现出多种器官向性和致病潜能。发病机制研究中最常用的毒株是嗜神经型MHV-JHM(以前称为MHV-4)、嗜肝/嗜神经型MHV-A59和嗜肝型MHV-3。这些啮齿动物的实验性感染为如多种人类疾病肝炎、脑炎和多发性硬化症等脱髓鞘疾病提供了动物模型。小鼠经鼻内或脑内途径感染MHV-JHM或MHV-A59可作为研究脑炎和神经毒性决定因素的模型。MHV是冠状病毒属冠状病毒科的一种。其基因组长32位碱基,包括不同的开放阅读框(orf),其内有编码四种结构蛋白的基因:突刺蛋白(S),包膜蛋白(E),膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N);其他一些菌株还表达编码另外两种结构蛋白的基因:血凝素酯酶(HE)和内部蛋白质(I)。病毒基因组还编码三个非结构蛋白,但对其功能仍知之甚少。冠状病毒病毒颗粒的组装需要三个结构蛋白的协同作用:膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。在这三种蛋白中,M和E蛋白无致病作用。
2.2脑炎的病毒分子决定因素
虽然对病毒致病机制的分子决定因素仍知之甚少,但有证据表明,宿主和病毒因素都在冠状病毒诱导的疾病中发挥作用。过去十年内进行的多个实验使用数种具有感染性的病毒cDNA克隆来产生高毒力和低毒力的病毒,并通过交互嵌合病毒的方法来研究神经毒力的分子决定因素。与MHV高神经致病性有关的病毒基因同样和病毒的传播、复制和固有/适应性免疫的激活有关。
2.2.1突刺蛋白:S
S蛋白介导病毒与靶细胞受体的附着,与细胞膜融合、进入细胞以及病毒在细胞间的传播。在以往研究的基础上,利用多种对中和性单克隆抗体存在抗性的病毒变体,研究了S基因的各种突变或缺失与不同MHV毒株的神经衰减之间的联系。最近,通过含有经修饰的S蛋白的重组MHV毒株的相关实验已经证明S蛋白是病毒神经毒力的主要决定因子。含有JHM的S基因的重组A59病毒(rA59)表现出高神经毒力。将病毒接种在小鼠大脑中达到LD50的所需病毒剂量较对照组降低了倍,充分体现了S蛋白在神经毒力中的作用。神经元感染一直被认为是MHV神经毒性的一个主要决定因素,最近重组病毒的使用表明,即使在神经毒性增加的条件下,rA59和rA59/SJHM重组病毒对神经元和星形胶质细胞的取向性并未发生变化。神经毒性的强度与脑内扩散的程度有关:扩散越快说明神经毒性越强。这种增强的病毒播散也会引起机体对感染产生更强的免疫反应。小鼠感染rA59+SJH或rA59+SA59后脑内淋巴细胞浸润程度是不同的,SJHM诱导淋巴细胞侵入CNS的高于SA59,并伴有CD8+T细胞百分率明显升高。免疫介导病理改变的增加与病毒的快速传播有关。携带JHM的S蛋白(SJHM)的重组病毒rA59的毒性不如野生型重组rJHM,说明神经毒性也依赖于其他背景基因。JHM的高神经毒力也与以大量的中性粒细胞和巨噬细胞浸润为特征的固有免疫反应增强有关,这一理论在比较携带SA59的rJHM和携带SJHM的rJHM引起的脑炎的急性期的表现中也得到了验证。然而,病毒株背景也起着重要的作用,与rJHM背景病毒相比,含有rA59基因的病毒可使得CD8+和CD4+T细胞浸润水平明显升高。病毒特异性CD8+T细胞是抵御神经嗜性冠状病毒的关键。因此,中枢神经系统的快速和广泛的传播,加上无法诱导强力的T细胞反应,综合导致了感染了JHM后小鼠的高死亡率。
2.2.2核衣壳蛋白:N
除了与病毒RNA基因组相关的N蛋白外,冠状病毒所有的结构单边都是位于包膜上的跨膜蛋白。将rA59的N基因替换为JHM(NJHM)的N基因,可使rA59具有高度的神经毒性。将重组病毒接种于小鼠大脑,达到LD50的所需剂量较原病毒降低~倍。相反,带有NA59的N基因的rJHM毒力是减弱的,但这在减毒表型(rA59/SJHM)上更明显,这表明MHV-JHM的N基因被MHV-A59的N基因取代后是减毒的。rA59/NJHM在中枢神经系统中比rA59传播得更快,而rJHM/NA59与rJHM相比,传播速度则有限得多。这些数据表明,N基因的背景决定了病毒的传播,也是病毒毒力的一个组成部分。NJHM被怀疑与微管有关,故而能够增加病毒沿轴突的传输,并有利于病毒在神经元之间的传播。但被rA59/NJHM感染的原代海马神经元与被rA59感染的细胞相比,病毒传播的速率并未明显增加。此外,N基因还影响T细胞向大脑的浸润:当病毒具有NA59的N基因时,CD4+和CD8+T细胞的反应较强,而具有NJHM的N基因时相应的细胞反应则较弱。
2.2.3血凝素酯酶蛋白:HE
血凝素酯酶(HE)是一种包膜糖蛋白,存在如人类冠状病毒(HCoV-OC43和HCoV-HKU1)、牛冠状病毒(BCoV)等β冠状病毒属的毒株中。MHV的JHM株表达HE糖蛋白,而MHV-A59则由于HE基因缺陷不表达该蛋白。MHV-A59能够在受其感染的小鼠中诱发脑炎,但由于该毒株的神经毒性不如MHV-JHM,引起的疾病也较为轻微。研究人员通过靶向RNA重组将MHV-JHM的HE基因导入MHV-A59基因组,探讨了HE基因在神经毒性中的作用。HE在MHV-A59背景中的表达既没有增加小鼠的毒力(通过LD50评估),也没有增加感染性病毒的产生(在大脑或肝脏组织中),也没有增加病毒的传播(通过病毒抗原的分布显示)。然而,Kazi和合作者证明被联合表达HE基因和MHV-JHM的S基因的rA59感染后,在疾病的预后有所改善的同时病毒在脑组织中的传播也被增强了,但病毒复制的情况未发生改变。他们的研究成果表明结构完整的HE蛋白和来自MHV-JHM毒株的S蛋白共同影响病毒的神经毒力。事实上,尽管S蛋白是决定组织趋向性和靶细胞感染的主要病毒因子,但HE病毒蛋白似乎是一种次要受体结合蛋白,增加了病毒在脑内的感染和传播。
2.3人类冠状病毒(HCoV)
人类冠状病毒(HCoV)是公认的呼吸道病原体,但在极少数情况下,它们可能与脑炎有关。如前所述,目前有五种不同的人类冠状病毒毒株:HCoV-OC43、HCoV-E、HCoV-NL-63、HCoV-HKU1和SARS-CoV,这五种毒株中至少有三种具有神经侵袭性。事实上,我们的实验室已经证明HCoV-OC43和HCoV-E可以感染人类神经细胞(神经元和神经胶质细胞),并确实存在于人类大脑中。其他报告提到在患有急性播散性脑脊髓炎的儿童体内存在HCoV-OC43。此外,年秋季发生在中国的SARS-CoV流行也有力地说明了由冠状病毒能够引发可能致命的疾病。由SARS-CoV引起的严重急性呼吸综合症通常通过接触受感染者咳嗽时喷射到空气中的飞沫传播。主要症状包括高烧、头痛、身体疼痛和肺炎。SARS爆发数年后,科学家发现SARS-CoV也能侵入脑组织并引起严重的中枢神经系统问题,如水肿、神经细胞退变和教会细胞增生;而由SARS死亡的患者大脑中也能检测到SARS-CoV的RNA。此外,使用表达已知病毒受体人类血管紧张素转换酶2(hACE-2)的转基因小鼠开展的相关实验表明SARS-CoV具有神经侵袭性:病毒通过嗅球到达大脑,在感染神经元的同时可抑制免疫细胞浸润,从而诱发可能致命的疾病。
2.3.1帮助理解人类冠状病毒感染的动物模型
我们通过建立一个实验动物模型来刻画HCoV-OC43的嗜神经性、神经侵袭性和神经毒性的特征。我们已经报道了HCoV-OC43经鼻内感染小鼠可导致急性脑炎和整个中枢神经系统的感染,证明了HCoV-OC43的神经侵袭性和神经毒性。中枢神经系统的损害似乎主要是病毒直接损伤神经细胞的结果。事实上,如图1所示,这种急性感染的目标是神经元,并引起后者发生空泡化和变性。我们还能够证明caspase相关的病毒诱导的神经元细胞凋亡在体内和体外实验中均可发生。这种在人类大脑中发生的病毒诱导的细胞凋亡引起了特别的